美国队长史蒂夫·罗杰斯（克里斯·埃文斯 饰）在现代生活中逐渐适应，但一次行动后，他发现神盾局内部充满了危险气息。得知神盾局正在秘密进行“洞察计划”后，他感到愤怒。一天，神盾局指挥官尼克-法瑞（塞缪尔·杰克逊 Samuel L. Jackson 饰）遭到武装分子袭击，他将U盘交给美国队长，里面藏有神盾局二战以来最重要且最可怕的秘密。 美国队长因涉嫌杀害尼克而被前局长亚历山大·皮尔斯（罗伯特·雷德福/Robert Redford 饰）通缉和追杀，逃亡中他得到了黑寡妇（斯嘉丽·约翰逊 Scarlett Johansson 饰）和退伍老兵“猎鹰”（安东尼·麦凯 Anthony Mackie 饰）的帮助。他们必须争分夺秒解开神盾局的秘密，阻止“洞察计划”的施行……